طراحی یک روش الایزای غیرمستقیم جهت عیار سنجی آنتی توکسین بتا کلستریدیوم پرفرینجنز تیپ C در سرم خرگوش

نوع مقاله : مقاله کامل

نویسندگان

بخش تحقیق و تولید واکسن‌های باکتریایی بی‌هوازی، کلستریدیا، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران

چکیده

کلستریدیوم پرفرینجنز عامل بیماری انتروتوکسمی می باشد که با ضرر و زیان شدید اقتصادی همراه است. ارزیابی ایمنی ناشی از واکسن در پیش گیری از این بیماری از اهمیت خاصی برخوردار است که به روش سرم نوترالیزاسیون انجام می شود. ولی به دلیل معایب آن، روش جایگزین الایزا در این طرح پیشنهاد گردید. در این تحقیق، پس از تهیه توکسین بتا و تخلیص آن، مقدار MLD و غلظت پروتئین آن به روش لوری محاسبه گردید. همچنین آنتی سرم کنترل مثبت، کنترل منفی و آنتی سرم از نمونه ها آماده سازی گردید. سپس آزمون الایزا (درون شیشه) و پتنسی (سرم نوترالیزاسیون) (درون تنی) به موازات هم انجام و نتایج با نرم افزار SPSS آنالیز گردید. میزان cut off کنترل منفی در آزمون الایزا ۴۳۵/۰ برآورد شد و در آزمون کراس مشخص گردید که الایزا برای شناسایی توکسین بتا اختصاصی عمل می نماید و میزان تکرار پذیری آن با استفاده از انحراف معیار ارزیابی گردید (برای نمونه حد متوسط ۰۳۳/۰ = SD و ۲۵/۷ = CV). نتایج این بررسی نشان داد ارتباط معنی داری از نظر آماری بین دو آزمون درون تنی و درون شیشه، در نمونه‌ سرم‌ خرگوشهای واکسینه با واکسن انتروتوکسمی وجود دارد. آنالیز رگرسیون خطی، همبستگی ۸۴/۰ با 01/0≥P را نشان داد. حساسیت، ارزش پیشگویی مثبت و منفی آزمون الایزا در این نمونه ها به ترتیب ۱۰۰٪، ۲۱/۸۴ و ۱۰۰٪ محاسبه گردید. در نهایت پیشنهاد گردید از الایزا به عنوان جایگزین تست سرم نوترالیزاسیون برای ارزیابی واکسن انتروتوکسمی در خرگوش استفاده نمود. اگرچه برای استفاده در حیوانات هدف نیاز به تحقیقات بیشتر در این زمینه ضروری می باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Designing of an Indirect ELISA Method for the Detection of Beta Antitoxin of Clostridium perfringens Type C in Rabbit Serum

نویسندگان [English]

  • L. Abdolmohammadi Khiav
  • A. Paradise
  • A. Hagh Roosta
Department anaerobic bacterial vaccine Production and Research, Clostridia Research laboratory, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, Iran
چکیده [English]

Clostridium perfringens is the causative agent of enterotoxaemia, which is related to severe economic losses. The evaluation of immunity of beta antitoxin, that prevented animals against the disease, is measured using potency (serum neutralization) technique that it has disadvantages. So Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) has been proposed as an alternative to SN. In this research, before and after purification of beta toxin, MLD and amount of protein was measured using Lowry method. Then, positive and negative control antiserum and samples antiserum were prepared. Then, we were measured beta antitoxin by ELISA and serum neutralization simultaneously and the results were analyzed by SPSS software.
The negative control cut-off was calculated 0.485 and cross-examination was shown that beta toxin used in this study has no cross reaction with other toxins of Clostridium perfringens and its repeatability was assessed using standard deviation (for Medium specimen: SD=0.033 CV=7.25) The results of this study showed that there is a significant agreement between in vivo and in vitro tests for serum samples of vaccinated rabbits by enterotoxaemia vaccine. Linear regression analysis gave correlation coefficients of 0.84 for the indirect ELISA, with a significance level of p < 0.01. Sensitivity, positive and negative predictive value of ELISA in these samples was 100%, 84.21% and 100%, respectively. Finally, ELISA systems are suitable candidates to replace the MNT used for detection antibody in laboratory animals. However, further research in this field is needed for target animals.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Clostridium perfringens type C
  • beta antitoxin
  • serum neutralization
  • ELISA
  • tetravalent enterotoxaemia vaccine

مراجع

- Babe, T., B. Jafari and S. Bahmanpour. 2012. Typing of toxigenic isolates of Clostridium perfringens by ELISA in ostrich. African Journal of Microbiology Research 6: 1766-1769.
2 - Berry, P., J. C. Rodhouse, S. Hughes, B. Bartholomew and R. Gilbert. 1988. Evaluation of ELISA, RPLA, and Vero cell assays for detecting Clostridium perfringens enterotoxin in faecal specimens. Journal of clinical pathology 41: 458-461.
3 - British Pharmacopoeia. 2017. Clostridium perfringens. Vet: 229-231.
4- Daube, G., P. Simon, B. Limbourg, C. Manteca, J. Mainil and A. Kaeckenbeeck. 1996. Hybridization of 2,659 Clostridium perfringens isolates with gene probes for seven toxins (alpha, beta, epsilon, iota, theta, mu, and enterotoxin) and for sialidase. American journal of veterinary research 57: 496-501.
5- Ebert, E., V. Öppling, E. Werner and K. Cussler. 1999. Development and prevalidation of two different ELISA systems for the potency testing of Clostridium perfringens β-and ε-toxoid containing veterinary vaccines. FEMS Immunology & Medical Microbiology 24: 299-311.
6- El Idrissi, A. H. and G. E. Ward. 1992. Development of double sandwich ELISA for Clostridium perfringens beta and epsilon toxins. Veterinary microbiology 31: 89-99.
7- Féraudet-Tarisse, C., C. Mazuet, S. Pauillac, M. Krüger, C. Lacroux, M. R. Popoff, B. G. Dorner, O. Andréoletti, M. Plaisance and H. Volland. 2017. Highly sensitive sandwich immunoassay and immunochromatographic test for the detection of Clostridial epsilon toxin in complex matrices. PloS one 12: e0181013.
8- Gurjar, A., J. Li and B. A. McClane. 2010. Characterization of toxin plasmids in Clostridium perfringens type C isolates. Infection and immunity 78: 4860-4869.
9- Krt, B. 1999. Development and evaluation of various enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Clostridium perfringens β anti-toxins. FEMS Immunology & Medical Microbiology 24: 293-297.
10 - Law, J. W.-F., N.-S. Ab Mutalib, K.-G. Chan and L.-H. Lee. 2015. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Frontiers in microbiology 5: 770.
11- Lowry, O., J. Rosebrough, A. Farr and R. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry 193: 265-275.
12 - Martin, P., R. Naylor and R. Sharpe. 1988. Detection of Clostridium perfringens β toxin by enzyme-linked immunosorbent assay. Research in veterinary science 44: 270-271.
13- Møller, K. and P. Ahrens. 1996. Comparison of Toxicity Neutralization-, ELISA-and PCR Tests for Typing of Clostridium perfringens and Detection of the Enterotoxin Gene by PCR. Anaerobe 2: 103-110.
14- Moreira, G. M. S. G., F. M. Salvarani, C. E. P. Da Cunha, M. Mendonça, Â. N. Moreira, L. A. Gonçalves, P. S. Pires, F. C. F. Lobato and F. R. Conceição. 2016. Immunogenicity of a trivalent recombinant vaccine against Clostridium perfringens alpha, beta, and epsilon toxins in farm ruminants. Scientific reports 6: 22816.
15 - Nagahama, M., K. Kobayashi, S. Ochi and J. Sakurai. 1991. Enzyme-linked immunosorbent assay for rapid detection of toxins from Clostridium perfringens. FEMS microbiology letters 84: 41-44.
16- Naylor, R., P. Martin and R. Sharpe. 1987. Detection of Clostridium perfringens epsilon toxin by ELISA. Research in veterinary science 42: 255-256.
17- Rosskopf-Streicher, U., P. Volkers and E. Werner. 2003. Control of Clostridium perfringens vaccines using an indirect competitive ELISA for the epsilon toxin component. Pharmeuropa bio 2: 91-96.
18- Sakurai, J. and M. Nagahama. 2006. Clostridium perfringens beta-toxin: characterization and action. Toxin Reviews 25: 89-108.
19- Sayeed, S., J. Li and B. A. McClane. 2010. Characterization of virulence plasmid diversity among Clostridium perfringens type B isolates. Infection and immunity 78: 495-504.
20 - Smith, D. 1986. The pathogenic Anaerobic Bacteria. Clostridium Perfringens. Chapter 7. Charles Thomas publisher. Spring field. USA.
21- Thomson, R. V. 16-18 november 1982. Quantitation of ovine Cl. perfringens epsilon and tetanus antitoxin by Enzyme immunoassay. IVth symposium of the commission for the study of animal diseases caused by anaerobes paris.
22- Uzal, F. A., K. Nielsen and W. Kelly. 1997. Detection of Clostridium perfringens type D epsilon antitoxin in serum of goats by competitive and indirect ELISA. Veterinary microbiology 57: 223-231.
23- Vidal, J. E., B. A. McClane, J. Saputo, J. Parker and F. A. Uzal. 2008. Effects of Clostridium perfringens beta-toxin on the rabbit small intestine and colon. Infection and immunity 76: 4396-4404.
24- Zayerzadeh, E., A. Fardipour and A. Jabbari. 2015. A New Purification Method for Beta-Toxin of Clostridium perfringens Type C Vaccinal Strain. Journal of Medical Bacteriology 3: 8-13.
25- Zhao, X., C.-W. Lin, J. Wang and D. H. Oh. 2014. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. Journal of Microbiology and Biotechnology 24: 297-312.

فایل ها

سابقه مقاله

  • تاریخ دریافت: 28 شهریور 1398
  • تاریخ بازنگری: 14 آبان 1398
  • تاریخ پذیرش: 09 آذر 1398

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار