کلونینگ و بیان ژن hly Listeria monocytogenes در Lactococcus lactis

نوع مقاله: مقاله کامل

نویسندگان

1 دانش‌آموخته دکتری تخصصی بیوتکنولوژی، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

2 استاد گروه بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

3 دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

4 باستادیار بخش ایمونولوژی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، شعبه شیراز، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، شیراز، ایران

چکیده

ژن hly یکی از مهم‌ترین عوامل ویرولانس Listeria monocytogenes می‌باشد که پروتئین لیستریولیزین (O (LLO را رمزگذاری می‌کند. LLO یک پروتئین ایمونوژن با قابلیت بالاست، که قادر به برانگیختن ایمنی سلولی و هومورال است و علاوه بر فعالیت همولیتیک، عملکردهای متعدد دیگری نیز دارد. این پروتئین با تخریب فاگولیزوزوم به فرار باکتری از سیتوپلاسم، زنده ماندن و رشد درون سلولیL. monocytogenes کمک می کند.از طرفی Lactococcus lactis سویه ای از باکتریهای اسید لاکتیک می‌باشد که برای بیان پروتئین‌های نوترکیب کاربرد زیادی دارد. هدف ما در این تحقیق بیان آنتی ژن نوترکیب LLO در سویه L. lactis بود.که این کاردر ابتدا با واسطه پلاسمید pTG19-T (وکتور T/A کلونینگ) و سپس با استفاده از پلاسمید pNZ8110 که مربوط به سیستم پلاسمیدهای بیانی ترشحی مختص L. lactis می‌باشد، انجام گردید. ژن hly، با طراحی محل برش آنزیم‌های محدود‌کننده در دو سر ژن، وارد پلاسمید شده و پس از کلونینگ و تکثیر در E. coli MC1061 بعنوان میزبان واسط با روش الکتروپوریشن وارد L. lactis گردیده و در نهایت پروتئین LLO بیان گردید. بیان این پروتئین با استفاده از روش SDS PAGE و وسترن بلات تایید شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Cloning and expression of Listeria monocytogenes hly in Lactococcus lactis

نویسندگان [English]

  • M. Hayati 1
  • S. Hosseinzadeh 2
  • M. Tabatabaei 3
  • S.M.H. Hosseini 4
1 Department of Pathobiology ,School of Veterinary Medicine. Shiraz University, Shiraz, Iran.
2 Department of Food Hyggiene and Quality Control , School of Veterinary Medicine. Shiraz University, Shiraz , Iran.
3 Department of Pathobiology ,School of Veterinary Medicine. Shiraz University, Shiraz, Iran.
4 Immunology department, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Shiraz Branch,Agricultural Research ,Education and Extension Organization (AREEO), Shiraz,Iran.
چکیده [English]

The hly gene is one of the most important virulence factors of Listeria monocytogenes encoding listeriolysin O (LLO). LLO is a potent immunogenic protein eliciting both cellular and humoral immunity and has manyother functions besides hemolytic activity. This protein mediates the bacterial escape to the cytoplasm by disruption of phagosomal membrane leading to intracellular survival and proliferation of L. monocytogenes. On the other hand, Lactococcus lactis is a lactic acid bacterium which has many applications in expression of recombinant proteins. Our aim in this study was expression of recombinant LLO in L. lactis strain. Initially, the pTG19-T plasmid which is a T/A cloning vectorwas employed and then pNZ8110 was used as a Lactococcal secretional expression plasmid to clone L. monocytogenese hly gene by restriction enzymes cutting and ligation method. After cloning and propagation in E. coli MC1061 intermediate host, it was electro-transformed into L. lactis. Expression of LLO was confirmed by SDS-PAGE and western blot.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Listeriolysin
  • Listeria monocytogenese
  • Lactococcus lactis
  • Cloning
1-Bahey-El-Din, M., P. G. Casey , B.T. Griffin and C.G.M. Gahan. 2008. Lactococcus lactis-expressing listeriolysin O (LLO) provides protection and specific CD8(+) T cells against Listeria monocytogenes in the murine infection model. Vaccine 26 (41): 5304-14.
2-Bahey-El Din, M., C.G.M. Gahan and B.T. Griffin. 2010a. Lactococcus lactis as a cell factory for delivery of therapeutic proteins. Current Gene Therapy 10, 34-45.
3-Bahey El Din M., P. G. Casey, B.T. Griffin and C.G.M. Gahan. 2010b. Expression of two Listeria monocytogenes antigens (P60 and LLO) in Lactococcus lactis and examination for use as live vaccine vectors. Journal of Medical Microbiology 20, 59 (Pt 8): 904-12.
4-Bermudez-Humaran, L.G. 2009. Lactococcus lactis as a live vector for mucosal delivery of therapeutic proteins, Human Vaccines, 5:4, 264-267.
5-Cornell, K.A. et al.,1999. Genetic immunization of mice against Listeria monocytogenes using plasmid DNA encoding listeriolysin O. Journal of Immunology 163 : 322-329.
6-del Rio, B., J. F. M .L.Seegers and M.Gomes-Solecki. 2010. Immune response to Lactobacillus plantarum expressing Borrelia burgdorferi OspA is modulated by the lipid modification of the antigen. PLoS ONE 5(6): e11199.
7-Dramsi, S. and P. Cossart. 2002. Listeriolysin O a genuine cytolysin optimized for an intracellular parasite. Journal of Cell Biology 18, 156(6): 943–946.
8-Giammarini, C. and F. Andreoni. 2004 . Purification and characterization of a recombinant listeriolysin O expressed in Eschrichia coli and possible diagnostic applications. Journal of Biotechnology 109: 13-20.
9-Henrich, B., J.R. Klein, B. Weber, C. Delorm, P. Renault and U. Wegmann. 2002. Food grade delivery system for controlled gene expression in Lactococcuslactis. Applied & Environmental Microbiology, 68 (11) :5429-5436.
10-Huang, J.M., R.M. LaRagione, W.A. Cooley, S.Todry and S.M., Cutting. 2008 . Cytoplasmic delivery of antigens by Bacillus subtilis enhances Th1 responses. Vaccine 26 . 6043-6052.
11-Johnston, C., A.O. Coffey, J.M. Mahonyand R.D. Sleator. 2009. Development of a novel oral vaccine against Mycobacterium avium paratuberculosis and Johnẻ̉s disease. Bioengineered Bugs 1:2, 1-8.
12-Kayal, S. and A. Charbit. 2006. Listeriolysin O: a key protein of Listeria monocytogenes with multiple functions. FEMS Microbiology Reviews 30, 4: 514-529.
13-Kunji, E.R., D.J. Slotboom and B. Poolman. 2003. Lactococcus lactis as host for overproduction of functional membrane proteins. Biochimistry Biophysic Acta 1610, 97-108.
14-Lety, M.A., C. Frehel, C. Raynaud, M. Dupuis and A. Charbit. 2006. Exploring the role of the CTL epitope region of listeriolysin O in the pathogenesis of Listeria monocytogenes. Microbiology152: 1287-96.
15-Leimeister-Wachter, M. and T. Chakraborty 1989. Detection of listeriolysin, thethiol dependent hemolysin in Listeria monocytogenes , Listeria ivanovii, and Listeria seeligeri. Infection and Immunity 57: 2350-2357.
16-Meyer-Morse, N. et al ., 2010. Listeriolysin O is necessary and sufficient to induce autophagy during Listeria monocytogenes infection. Journal PLoS ONE 5(1).
17-Mierau, I., and M. Kleerebezem. 2005. 10 years of nisin controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Applied Microbiology and Biotechnology.
18-NIZO food research BV. MoBiTec Molecular Biotechnology. 2010. NICE Expression System for Lactococcus lactis. Available online at: www.yrgene.com/documents/vector/nice.pdf.
19-Sambrook, J., and D.W. Russel. 2001. Molecular cloning.Third edition. New York , USA Cold Spring Harbor Laboratory Press.
20- Sirard, J.C., C. Fayolle, D.C. Chastollier, M. Mock, C. Leclerc and P. Borche. 1997 .Intracytoplasmic delivery of listeriolysin O by a vaccinal strain of Bacillus indicus CD8+ mediated protection against Listeria monocytogenes. Journal of Immunology 159(9). 4435-43.
21- Stachowiak, R., M. Lyzniak, M. Grabowska, K. Roeske, T. Jagielski, J. Bielecki, et al. 2014. Cytotoxicity of purified listeroplysin O on mouse and human leukocytes and leukemia cells. BMC Biotechnology .14 (77).
22- Vázquez-Boland,J.A., M. Kuhn, P. Berche, T. Chakraborty, G. Gustavo Domínguez-Bernal, et al.,2001. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Review 14(3): 584–640.
23- Xu, J.J et al., 2006. Characterization of a recombinant Listeria monocytogenes strain containing the fusion protein gene of newcastle disease virus. Acta Microbiologica Sinica 43 (3) :445-450.
24- Yin, Y.L., X.A. Jiao, Z.M. Pan, X.M. Zhang and Z.Q. Gu. 2004. Prokaryotic expression and bioactivity of the Listeria monocytogenes listeriolysin O. Acta Microbiologica Sinica 44(6) : 752-755.